柱填料的物理性能對填料色譜行為有重要影響,填料主要的物理性能包括如下:顆粒度,孔徑,孔體積,鍵合相化學(xué),含碳量及烷基化處理。
(1)顆粒度是指柱填料的顆粒直徑的大小,實際上色譜柱上所標(biāo)的粒徑是一個平均值,如粒徑“5μm”并不是柱中填料所有的顆粒直徑都是5μm,實際上有一個顆粒分布度,這種分布度對柱反壓及柱效有重要作用,一般來說,平均顆粒度越小,顆粒分布度越小,色譜柱效越高,反壓亦越高,目前C18柱色譜柱填料粒徑在4~10μm之間。
(2)孔徑是指填料顆粒間的孔間隙,一般所說的孔徑是指填料的平均孔徑,球形填料裝柱后平均孔徑分布比較窄,柱床結(jié)構(gòu)均勻,柱效高,重現(xiàn)性好,無定形填料平均孔徑分布較寬,柱床結(jié)構(gòu)不均勻,流動相線性速度不均勻,譜帶擴(kuò)寬,平均孔徑的大小對分離大分子化合物有較大的影響,在分離含有較大分子的樣品時可能會有分子排阻效應(yīng),或產(chǎn)生吸附效應(yīng)從而影響定量的回收率及準(zhǔn)確度,色譜柱因而在用反相色譜分離諸如蛋白或多肽樣品時應(yīng)考慮選用大孔徑(如30nm)的反相柱填料,孔體積作為硅膠多孔性的參數(shù),在分離分析較大分子化合物時可作參考,選用較大孔體積的反相柱填料。
?。?)化學(xué)鍵合相填料在高效液相色譜法中占有極重要的地位,它可以鍵合極性較大的有機(jī)基團(tuán),采用極性較小的溶劑作流動相,亦可鍵合極性較小的有機(jī)基團(tuán),選用極性較大的溶劑作流動相。
一種可能是由于流動相pH值超出建議范圍而導(dǎo)致色譜柱塌陷,這也可能是由于色譜柱樣品溶解在強(qiáng)酸或堿性溶液中引起的。
此外,還有一些色譜柱用于特定的項目,例如氨基柱與醛和酮會發(fā)生反應(yīng),在無緩沖的水溶液中的氨基柱會產(chǎn)生強(qiáng)堿性,導(dǎo)致部分硅膠溶解。
如果使用了錯誤的溶劑,色譜柱也會塌陷,原因是色譜柱從根本上說是非常松散的結(jié)構(gòu),它們通過顆粒彼此的粘附而部分地保持在一起,當(dāng)將其置于能夠破壞這種粘附力的流動相中時,塌陷的可能性就會增加,這偶爾會發(fā)生在中等極性溶劑中的氰基柱或THF中的苯基柱。
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