反相色譜柱具有硅膠和聚苯乙烯色譜柱的優(yōu)點(diǎn)，摒棄了這兩種色譜柱的缺點(diǎn)。以乙烯醇共聚物為基質(zhì)的色譜柱，即使碳含量高，也能保持表面濕潤。多孔結(jié)構(gòu)對小分子化合物有足夠的平均孔徑.肽和小分子蛋白可以產(chǎn)生理想的分離效果。在有機(jī)溶劑比例較高的流動(dòng)相中，色譜柱具有與硅膠基質(zhì)色譜柱相同的柱效應(yīng)，但在堿性緩沖溶液為流動(dòng)相的情況下，其分離效率超過硅膠色譜柱。其中一個(gè)顯著的特點(diǎn)是烷基填料的洗滌順序，其保留能力與碳鏈的長度成正比。

反相色譜柱的活化步驟:

1.用20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱；

2.如果流動(dòng)相含有緩沖鹽，用與流動(dòng)相中鹽相等比例的超純水和有機(jī)相沖洗過渡。用量為20倍柱體積，然后用含緩沖鹽的流動(dòng)相平衡色譜柱，用量為20倍柱體積或以上；

3.流動(dòng)相不含緩沖鹽的，用流動(dòng)相平衡色譜柱，用量為20倍以上；

4.壓力基線穩(wěn)定，如不穩(wěn)定，可延長平衡時(shí)間。

優(yōu)化反相色譜柱的條件：

確定色譜柱規(guī)格.適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嘀盍?流動(dòng)相溶劑和改性劑后，可以開始優(yōu)化方法。方法的優(yōu)化是根據(jù)目標(biāo)來決定的。如果你想開發(fā)一種質(zhì)量控制方法，可能需要更少的可變因素，比如等度分離。如果目標(biāo)是獲得更高的分離度，節(jié)省分析時(shí)間并不是主要問題，你可以選擇一個(gè)長柱來獲得更大的分離度。如果分離速度非常重要，則應(yīng)使用短柱和高流速。對于含有許多保留不同目標(biāo)化合物的復(fù)雜樣品，等度分離可能無法解決問題，應(yīng)開發(fā)和優(yōu)化梯度方法。

水相溶劑和反相色譜中的弱溶劑被稱為流動(dòng)相“A”，“B”溶劑是一種具有高相和強(qiáng)相的溶劑。在反相色譜模式下，當(dāng)B的百分比增加時(shí)，保留率通常會降低。請注意，在開發(fā)樣品的實(shí)際分析方法之前，大多數(shù)人都開發(fā)了HPLC采用所有方法“反復(fù)實(shí)驗(yàn)”方法，即嘗試各種流動(dòng)相條件，以找出更好的條件。