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色譜分析原理，看完這篇秒懂！

欄目：行業(yè)資訊 發(fā)布時間：2023-03-24
色譜法（chromatography）又稱“色譜分析”、“色譜分析法”、“層析法”，是一種分離和分析方法，在分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用。
色譜法（chromatography）又稱“色譜分析”、“色譜分析法”、“層析法”，是一種分離和分析方法，在分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用。

色譜法的起源

色譜法的創(chuàng)始人是俄國的植物學(xué)家茨維特（ M.Tswett）。1906年，俄國植物學(xué)家茨維特發(fā)表了他的實驗結(jié)果：為了分離植物色素，他將含有植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸鈣顆粒表面的吸附力不同，隨著淋洗的進(jìn)行，不同色素向下移動的速度不同，從而形成一圈圈不同顏色的色帶，使各色素成分得到了分離。他將這種分離方法命名為色譜法(chromatography)。

植物葉色素的分離實驗示意圖
隨著分離手段的不斷發(fā)展，越來越多的無色物質(zhì)成為被分離的對象，色譜也漸漸失去了“色”的含義，但這個名稱卻沿用至今。

色譜法分類

色譜法的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流動相之間分配平衡的過程，不同的物質(zhì)在兩相之間的分配會不同，這使其隨流動相運動速度各不相同，隨著流動相的運動，混合物中的不同組分在固定相上相互分離。根據(jù)不同的機(jī)制，可以分多種類別。
1、按兩相物理狀態(tài)分類
流動相：氣相色譜、液相色譜、超臨界流體色譜
固定相：氣－固、氣－液；液－固、液－液
2、按固定相的形式分類
柱色譜：填充柱色譜、毛細(xì)管柱色譜、微填充柱色譜、制備色譜
平面色譜：紙色譜、薄層色譜、高分子膜色譜
3、按分離機(jī)制分類
吸附色譜：根據(jù)不同組分在吸附劑上的吸附和解吸能力的大小而分離
分配色譜：根據(jù)不同組分在固定液中溶解度的大小而分離
分子排阻色譜：依據(jù)分子體積大小不同進(jìn)行分離ln離子交換色譜：不同組分對離子交換樹脂的親和力不同而分離
親和色譜：利用生物大分子之間的存在的專一的特殊親和力進(jìn)行分離
毛細(xì)管電泳：依據(jù)各組分淌度和（或）分配行為的差異進(jìn)行分離
手性色譜：用于手性藥物的分離分析，可分為三類：手性衍生化試劑法；手性流動相添加劑法；手性固定相拆分法

色譜法的基本術(shù)語

檢測色譜分離后組分的響應(yīng)信號對時間作圖得到的曲線稱為色譜圖。
色譜流出曲線
基線：在一定色譜條件下，僅有流動相通過檢測器系統(tǒng)時所產(chǎn)生的信號的曲線，稱為基線，如圖中ot線。實驗條件穩(wěn)定時，基線是一條平行于橫軸的線；基線反映儀器（主要是檢測器）的噪聲隨時間的變化。
峰高：色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以h表示，如圖AB’線。
區(qū)域?qū)挾?/strong>：色譜峰的區(qū)域?qū)挾戎苯优c分離效率有關(guān)。描述色譜峰寬的方法有三種：標(biāo)準(zhǔn)偏差σ、峰寬W、半峰寬W1/2。
標(biāo)準(zhǔn)偏差（σ）：σ為正態(tài)分布曲線上兩拐點間距離之半，σ值的大小表示組分離開色譜柱的分散程度。σ值越大，流出的組分越分散，分離效果變差；反之，流出組分集中，分離效果好。
峰寬W：通過色譜峰兩側(cè)的拐點作切線，在基線上的截距稱為峰寬，或稱基線寬度，也可用W表示，如圖IJ 的距離。根據(jù)正態(tài)分布的原理 ，可證得峰寬和標(biāo)準(zhǔn)差的關(guān)系是W=4σ。
半峰寬W1/2：峰高一半處的峰寬稱為半峰寬，如圖 GH 的距離。W1/2=2.355σ，W=1.699W1/2。
W1/2、W都是由σ派生而來的，除用它們衡量柱效外，還用于計算峰面積。半峰寬測量較方便，最為常用。


小結(jié)


由色譜峰流出曲線可以實現(xiàn)以下目的：
a、依據(jù)色譜峰的保留值進(jìn)行定性分析
b、依據(jù)色譜峰的面積或峰值進(jìn)行定量分析
c、依據(jù)色譜峰的保留值及峰寬評價色譜柱的分離效能

色譜法涉及到的計算公式

1、保留值
保留值是用來描述樣品組分在色譜柱中保留程度的參數(shù)，并作為色譜定性的指標(biāo)。其表示方法有：
2、相對保留值
相對保留值又稱分離因子、分配系數(shù)比或相對容量因子，即在一定色譜條件下，被測組分的調(diào)整保留時間（體積）與標(biāo)準(zhǔn)物的調(diào)整保留時間（體積）之比。
采用相對保留值是為了消除某些操作條件，如流速和固定液流失等，對保留值的影響。相對保留值中標(biāo)準(zhǔn)物可以是被測樣品中的某一組分，也可以是人為加入的某一化合物。
3、保留指數(shù)
保留指數(shù)為待測物質(zhì)i在某固定液X上的保留指數(shù)，選取兩個正構(gòu)烷烴作為基準(zhǔn)物質(zhì)，其中一個的碳數(shù)為N，另一個為N+n，它們的調(diào)整保留時間分別為t’R(N)和 t’R(N+n)，使待測物質(zhì)i的調(diào)整保留時間t’R(i)恰好于兩者之間，即t’R(N)
保留指數(shù)的計算式為：
4、容量因子（k）
在平衡狀態(tài)下，組分在固定相(s)與流動相(m)中的質(zhì)量之比，稱為容量因子。公式如下：
5、分配系數(shù)（K）
在平衡狀態(tài)下，組分在固定相(s)與流動相(m)中的濃度之比，稱為分配系數(shù)。公式如下：

K與k的關(guān)系：


小結(jié)


保留值與容量因子及分配系數(shù)的關(guān)系：
色譜分離是基于固定相對試樣中各組分的吸附或溶解能力強弱的不同，而這種吸附或溶解能力的強弱可定量地用分配系數(shù)K（或容量因子k）值的大小來表示。
吸附或溶解能力強的組分分配系數(shù)（或容量因子）大，保留時間長；反之，吸附或溶解能力弱的組分分配系數(shù)小，保留時間短。

色譜法的基本理論

1、塔板理論
（1）提出——熱力學(xué)理論
始于馬?。∕artin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。
分餾塔：在塔板上多次氣液平衡，按沸點不同而分離。
色譜柱：組分在兩相間的多次分配平衡，按分配系數(shù)不同而分離。
（2）假設(shè)
（1）色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)可以很快達(dá)到分配平衡。
（2）流動相進(jìn)入色譜柱，不是連續(xù)的而是脈動式的，即每次通過為一個塔板體積。
（3）樣品加在每個塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散可以忽略。
（4）在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無關(guān)。即分配系數(shù)在各塔坂上是常數(shù)。
（3）原理
塔板理論示意圖
若有單位質(zhì)量，即m=1（例1mg或1μg）的某組分加到第0號塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。
當(dāng)一個板體積（lΔV）的載氣以脈動形式進(jìn)入0號板時，就將氣相中含有nm部分組分的載氣頂?shù)?號板上，此時0號板液相中ns部分組分及1號板氣相中的nm部分組分，將各自在兩相間重新分配。故0號板上所含組分總量為0.5，其中氣液兩相各為0.25而1號板上所含總量同樣為0.5．氣液相亦各為0.25。
以后每當(dāng)一個新的板體積載氣以脈動式進(jìn)入色譜柱時，上述過程就重復(fù)一次(見下表)。

（4）色譜流出曲線方程


（5）色譜柱效參數(shù)

在tR一定時，W或W1/2越小(即峰越窄)，理論板數(shù)n越大， 理論板高越小，柱的分離效率越高。有效理論塔板neff也同此理。因此，理論塔板數(shù)是評價柱效能的指標(biāo)。

（6）特點及不足

2、速率理論
1956年荷蘭學(xué)者VanDeemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動力學(xué)因素結(jié)合起來，提出了色譜過程的動力學(xué)理論——速率理論，導(dǎo)出了Van Deemter方程。它把色譜過程看作一個動態(tài)非平衡過程，研究過程中的動力學(xué)因素對峰展寬（即柱效）的影響。
后來Giddings和Snyder等人在VanDeemter方程（后稱氣相色譜速率方程）的基礎(chǔ)上，根據(jù)液體與氣體的性質(zhì)差異，提出了液相色譜速率方程（即Giddings方程）。
（1）Van Deemter方程
（2） Giddings方程

定量與定性分析

（一）定性分析
色譜定性分析就是要確定各色譜峰所代表的化合物。由于各種物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定的保留值，因此保留值可作為一種定性指標(biāo)。目前各種色譜定性方法都是基于保留值的。
但是不同物質(zhì)在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保留值，即保留值并非專屬的。因此僅根據(jù)保留值對一個完全未知的樣品定性是困難的。如果在了解樣品的來源、性質(zhì)、分析目的的基礎(chǔ)上，對樣品組成作初步的判斷，再結(jié)合下列的方法則可確定色譜峰所代表的化合物。
1、利用純物質(zhì)對照定性
在一定的色譜條件下，一個未知物只有一個確定的保留時間。因此將已知純物質(zhì)在相同的色譜條件下的保留時間與未知物的保留時間進(jìn)行比較，就可以定性鑒定未知物。若二者相同，則未知物可能是已知的純物質(zhì)；不同，則未知物就不是該純物質(zhì)。
純物質(zhì)對照法定性只適用于組分性質(zhì)已有所了解，組成比較簡單，且有純物質(zhì)的未知物。
2、相對保留值法

在某一固定相及柱溫下，分別測出組分i和基準(zhǔn)物質(zhì)s的調(diào)整保留值，再按上式計算即可。用已求出的相對保留值與文獻(xiàn)相應(yīng)值比較即可定性。
3、加入已知物增加峰高法
當(dāng)未知樣品中組分較多，所得色譜峰過密，用上述方法不易辨認(rèn)時，或僅作未知樣品指定項目分析時均可用此法。
首先作出未知樣品的色譜圖，然后在未知樣品加入某已知物，又得到一個色譜圖。峰高增加的組分即可能為這種已知物。
4、保留指數(shù)定性法
保留指數(shù)表示物質(zhì)在固定液上的保留行為，是目前GC中使用最廣泛并被國際上公認(rèn)的定性指標(biāo)。它具有重現(xiàn)性好、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一及溫度系數(shù)小等優(yōu)點。
保留指數(shù)僅與固定相的性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與其它實驗條件無關(guān)。其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都很好。只要柱溫與固定相相同，就可應(yīng)用文獻(xiàn)值進(jìn)行鑒定，而不必用純物質(zhì)相對照。
（二）定量分析
1、峰面積測量方法
峰面積是色譜圖提供的基本定量數(shù)據(jù)，峰面積測量的準(zhǔn)確與否直接影響定量結(jié)果。對于不同峰形的色譜峰采用不同的測量方法。
2、定量校正因子
3、定量計算方法
（1）面積歸一化法
（2）外標(biāo)法
以待測組分純品為對照物，與試樣中待測組分的響應(yīng)信號相比較進(jìn)行定量的方法。
（3）內(nèi)標(biāo)法
所謂內(nèi)標(biāo)法，是將一定量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物加入到待測物的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中，再進(jìn)行分析測定的方法。
（4）標(biāo)準(zhǔn)加入法