帶你了解HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)時(shí)已知雜質(zhì)的計(jì)算方法
HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)中已知雜質(zhì)的測定方法很多, 計(jì)算方法也相應(yīng)很多。每種計(jì)算方法都有不同的意義及其優(yōu)缺點(diǎn), 下面參考國內(nèi)外藥品標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)期刊文獻(xiàn), 結(jié)合在藥品檢驗(yàn)中的實(shí)際工作, 對這些計(jì)算方法作一簡單探討。
表1是各種計(jì)算方法的計(jì)算公式及其主要優(yōu)缺點(diǎn) 主成分對照品外標(biāo)法 《美國藥典》多采用加校正因子或不加校正因子的主成分對照品外標(biāo)法來對已知雜質(zhì)進(jìn)行計(jì)算。 方法介紹 主成分對照品外標(biāo)法包括加不校正因子的主成分對照品外標(biāo)法和加校正因子的主成分對照品外標(biāo)法。 操作、計(jì)算分別與不加校正因子和加校正因子的主成分自身對照法基本一樣，唯一不同的是前者要用主成分對照品制備一個(gè)濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷φ掌啡芤? 后者是由供試品溶液直接稀釋得到一個(gè)濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷φ杖芤骸?/span> 優(yōu)缺點(diǎn) 由于主成分對照品是經(jīng)過標(biāo)定的, 其純度或量值會比較準(zhǔn)確, 而制劑中主成分的實(shí)際含量與標(biāo)示量有時(shí)會不完全一致, 因此采用對照品外標(biāo)法計(jì)算出的雜質(zhì)的實(shí)際絕對含量要比自身對照法準(zhǔn)確一些。 當(dāng)然, 由于本法要使用主成分對照品，從而導(dǎo)致操作成本會提高一些, 操作過程會繁瑣一些。 雜質(zhì)對照品外標(biāo)法 方法介紹 雜質(zhì)對照品外標(biāo)法要求提供一定純度的雜質(zhì)對照品, 分析時(shí)需制備一個(gè)濃度應(yīng)與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛殡s質(zhì)對照品溶液。由于雜質(zhì)對照品外標(biāo)法可以解決上述幾種測定方法和計(jì)算方法存在的種種問題, 特別是雜質(zhì)與主成分響應(yīng)不一致的問題, 因此, 本法能反映藥品中該雜質(zhì)的真實(shí)含量。 優(yōu)缺點(diǎn) 如果雜質(zhì)對照品容易獲得并能持續(xù)供應(yīng), 建議在有關(guān)物質(zhì)檢查中已知雜質(zhì)的測定和計(jì)算時(shí)首選該法, 特別是當(dāng)該雜質(zhì)與主成分的相對響應(yīng)因子相差較大(超出0.9 ～ 1.1范圍)或該雜質(zhì)有毒副作用時(shí), 歐美藥典中采用此法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)計(jì)算的品種也不在少數(shù)。 圖片來源于網(wǎng)絡(luò)，侵刪 加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對照品外標(biāo)法 方法介紹 加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對照品外標(biāo)法其實(shí)也是雜質(zhì)對照品外標(biāo)法的一種。 本法的操作方法與測定方法同雜質(zhì)對照品外標(biāo)法一樣, 不同的是在計(jì)算公式中多乘以一個(gè)轉(zhuǎn)換因子, 其意義就是把樣品中某一雜質(zhì)的含量轉(zhuǎn)換成相當(dāng)于主成分本身的重量百分比水平。 優(yōu)缺點(diǎn) 結(jié)果較準(zhǔn)確。但由于雜質(zhì)的分子量可能大于或小于主成分的分子量(即主成分的分子量/雜質(zhì)的分子量可能小于1或大于1), 因此采用本法計(jì)算出的某一雜質(zhì)的含量結(jié)果也可能比面積歸一化法、主成分自身對照法、主成分對照品外標(biāo)法和雜質(zhì)對照品外標(biāo)法計(jì)算出的結(jié)果偏低或偏高。 主成分對照品外標(biāo)法 方法介紹 加轉(zhuǎn)換因子和校正因子的主成分對照品外標(biāo)法其實(shí)也是主成分對照品外標(biāo)法的一種, 就是在加校正因子的主成分對照品外標(biāo)法的基礎(chǔ)上乘以轉(zhuǎn)換因子。 優(yōu)缺點(diǎn) 結(jié)果較準(zhǔn)確。但由于雜質(zhì)的分子量可能大于或小于主成分的分子量(即主成分的分子量/雜質(zhì)的分子量可能小于1或大于1), 因此采用本法計(jì)算出的某一雜質(zhì)的含量結(jié)果也可能比面積歸一化法、主成分自身對照法、主成分對照品外標(biāo)法和雜質(zhì)對照品外標(biāo)法計(jì)算出的結(jié)果偏低或偏高。 圖片來源于網(wǎng)絡(luò)，侵刪 內(nèi)標(biāo)法 方法介紹 按各品種項(xiàng)下的規(guī)定, 分別精密量取含有一定濃度內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的對照品溶液和供試品溶液, 注入液相色譜儀, 記錄色譜圖, 測定對照品溶液中對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積及供試品溶液中待測成分(這里指待測雜質(zhì))和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積。 優(yōu)缺點(diǎn) 內(nèi)標(biāo)法主要是為了解決儀器進(jìn)樣精密度和藥物中所含成分的回收率的問題, 這種方法可以抵消儀器和過程帶來的誤差。但在以常壓六通閥定量環(huán)進(jìn)樣和回收率已經(jīng)驗(yàn)證的情況下, 意義已不大, 加之內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇比較困難, 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的添加會導(dǎo)致分離難度的增大, 操作過程更加煩瑣等問題, 本法已經(jīng)使用很少。 面積歸一化法 優(yōu)缺點(diǎn) 具有與稱樣量及進(jìn)樣量基本不相關(guān)的特點(diǎn), 因此重復(fù)性和重現(xiàn)性均良好, 不需要折算, 降低了實(shí)驗(yàn)中對稱樣量精密度的要求, 降低了檢驗(yàn)成本, 操作更加簡便、快捷, 省去了計(jì)算過程。 但當(dāng)雜質(zhì)是微量的時(shí)候需增加方法的靈敏度, 就要增加進(jìn)樣量, 此時(shí)主成分可能超出儀器檢測范圍, 或雖然在儀器檢測范圍內(nèi), 理論上講此時(shí)可能與主成分不在同一線性范圍內(nèi)。 正是由于各雜質(zhì)的響應(yīng)因子不同、含量較低和需要較寬的線性范圍等因素的影響,《中國藥典》2005年版二部附錄中特別強(qiáng)調(diào)“本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定外, 一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查” 這也在一定程度上限制了本法的使用。 不加校正因子的主成分自身對照法 此方法是現(xiàn)行版《中國藥典》和其他國家藥品標(biāo)準(zhǔn)及藥品研發(fā)時(shí)制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用最多、最廣泛的有關(guān)物質(zhì)的測定方法和計(jì)算方法。 方法介紹 配制一個(gè)濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)墓┰嚻啡芤鹤鳛閷φ杖芤? 一般是由供試品溶液直接稀釋得到。本法不需要雜質(zhì)對照品, 當(dāng)無法獲得雜質(zhì)對照品時(shí), 可采用不加校正因子的主成分自身對照法來計(jì)算雜質(zhì)的含量。 同面積歸一化一樣, 本法也是在假定供試品溶液中所有成分均出峰、所有雜質(zhì)均與主成分分離且各雜質(zhì)和主成分的響應(yīng)因子均相同的前提下進(jìn)行的。 優(yōu)缺點(diǎn) 同面積歸一化一樣, 本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、運(yùn)算方便, 無需雜質(zhì)對照品;缺點(diǎn)是忽略了各雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子可能不同的事實(shí), 導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)測得的雜質(zhì)含量可能與真正的雜質(zhì)含量不一致。 圖片來源于網(wǎng)絡(luò)，侵刪 加校正因子的主成分自身對照法 目前在國內(nèi)應(yīng)用較少, 但在國外藥品標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用比較廣泛。 方法介紹 該方法的操作步驟基本與上法相同, 唯一不同的是在計(jì)算時(shí)把雜質(zhì)相當(dāng)于主成分的響應(yīng)因子考慮進(jìn)去。本法相當(dāng)于一個(gè)簡化的內(nèi)標(biāo)法, 同時(shí)也是對雜質(zhì)對照品外標(biāo)法的簡化, 即在研究方法學(xué)時(shí), 利用雜質(zhì)對照品和主成分對照品, 分別測定雜質(zhì)和主成分的線性方程, 以斜率之比計(jì)算雜質(zhì)相對于主成分的校正因子, 此校正因子可直接載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中, 在常規(guī)檢驗(yàn)時(shí)用以校正該雜質(zhì)的實(shí)測峰面積。在實(shí)際測定時(shí), 可采用相對保留時(shí)間進(jìn)行雜質(zhì)定位。 優(yōu)缺點(diǎn) 此法的優(yōu)點(diǎn)是在日常檢驗(yàn)中省去了雜質(zhì)對照品(特別是在雜質(zhì)不夠穩(wěn)定或?qū)砉?yīng)有困難時(shí)顯得尤其重要), 同時(shí)又考慮到了雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子可能不同所引起的測定誤差;缺點(diǎn)是相對保留時(shí)間在不同實(shí)驗(yàn)室間可能有所波動(dòng), 特別是當(dāng)供試品中存在多個(gè)雜質(zhì)而又分離不好時(shí)可能造成雜質(zhì)定位困難。 需要指出的是，如果已知雜質(zhì)對主成分的相對響應(yīng)因子超出0.9 ～ 1.1范圍時(shí), 宜用加校正因子的主成分自身對照法或雜質(zhì)對照品外標(biāo)法法進(jìn)行計(jì)算。
此外, 不加校正因子的主成分自身對照法會存在稀釋步驟、進(jìn)樣針和進(jìn)樣閥殘留、進(jìn)樣誤差等影響因素, 往往也會導(dǎo)致計(jì)算出的雜質(zhì)與真實(shí)含量之間存在一定的誤差；但不加校正因子的主成分自身對照法可以解決面積歸一化法中可能出現(xiàn)的儀器檢測范圍和線性范圍問題。
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