色譜方法開發(fā)時(shí)，一般選擇常用的試劑、pH條件、緩沖鹽、以及常用色譜柱的組合作為起始條件，然后對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行一系列調(diào)整，直至獲得比較滿意的峰形和分離效果，如何正確科學(xué)地選擇液相流動(dòng)相呢？

原則1：由強(qiáng)到弱

 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。

原則2：三倍規(guī)則

 每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過(guò)程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況。

原則3：粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)

當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。

甲酸：通常使用的濃度在0.5%以下，能夠讓水的pH達(dá)到二點(diǎn)幾的級(jí)別。

乙酸：酸性比甲酸略弱，通常使用濃度不超過(guò)0.5%，能夠使水的pH到達(dá)到二點(diǎn)幾的級(jí)別。

三氟乙酸：比較強(qiáng)的酸，使用濃度通常不超過(guò)0.5%，能使水的pH達(dá)到2以下，具有很大的離子強(qiáng)度及一定的離子對(duì)作用，是分析蛋白/多肽時(shí)常用的添加劑。

磷酸：這是一種不揮發(fā)性的酸，離子強(qiáng)度也不錯(cuò)，最重要的是，它在低波長(zhǎng)紫外區(qū)無(wú)本底吸收。

堿類添加劑常見的是氨水和三乙胺，兩者都能讓水的pH到達(dá)非常高的水平，高到能把硅膠顆粒溶解掉。

甲酸鹽：通常在液相色譜中常用的甲酸鹽都是甲酸銨，而甲酸鹽與甲酸配合，可以得到甲酸-甲酸銨緩沖體系，大概緩沖能力在pH3～4.5的范圍之內(nèi)，只要調(diào)節(jié)兩者濃度的比例即可。

乙酸鹽：常見為乙酸銨，在使用上，和甲酸鹽十分類似，離子強(qiáng)度也不高。與乙酸配合的乙酸-乙酸銨緩沖體系pH的控制能力在pH4～5.5左右。

磷酸鹽 ：常用的是磷酸的鈉鹽和鉀鹽，二者對(duì)pH的控制能力十分接近，只是離子強(qiáng)度稍有差異，絕大多數(shù)情況下是可以互換使用的，磷酸由于是多元酸，能夠形成一氫鹽和二氫鹽，所以使用磷酸緩沖體系調(diào)節(jié)pH也是組合比較多，跨度比較大的，并且可以提供較高的離子強(qiáng)度。

磷酸-磷酸二氫鈉：pH1.2～3.1左右的范圍；

磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉：pH6.5～8左右的范圍。

最后，比起單純的酸堿，鹽類，特別是具有緩沖能力的鹽類可以很好的控制流動(dòng)相的pH值，根據(jù)不同緩沖鹽中兩種鹽的配比，可以很容易的配置出一定pH的緩沖溶液。上述的緩沖對(duì)能調(diào)節(jié)的pH范圍指的都是在保持緩沖能力的范圍之內(nèi)，如果僅僅是調(diào)節(jié)pH的話，范圍還可以再擴(kuò)展一些。

此外，當(dāng)分析物含有可電離官能團(tuán)時(shí)，（在不同pH條件下可處于不同程度的電離狀態(tài)，如伯、仲、叔氨基、羧酸基），pH條件將強(qiáng)烈影響分析物的反相保留狀態(tài)，也會(huì)造成最強(qiáng)烈的選擇性改變效果。

對(duì)于可電離的化合物，要獲得最強(qiáng)的反相保留，分析物應(yīng)盡可能的不帶電或電離，此時(shí)分析物極性相對(duì)較小，在反相色譜柱上的保留就更強(qiáng)，中性化合物無(wú)任何可電離基團(tuán)，不受pH影響。

酸性和堿性化合物在其未電離狀態(tài)下時(shí)反向保留最大，中性化合物的保留不受pH影響。

在選擇流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)避免在化合物分子的pKa值附近篩選pH條件，否則，pH值的微小變化都會(huì)導(dǎo)致保留和選擇性的劇烈變化。保留曲線的平臺(tái)區(qū)是分析方法耐用性較強(qiáng)的區(qū)域。流動(dòng)相中有鹽時(shí)，應(yīng)確保鹽不會(huì)析出。

采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。