這篇推文將對(duì)高效液相色譜法（HPLC）做一個(gè)簡單的介紹，讓初步接觸液相色譜知識(shí)的人員有一個(gè)資料進(jìn)行閱覽，如果有不嚴(yán)密的地方請(qǐng)包涵。

色譜法是一種利用物質(zhì)的溶解性、吸附性等理化性質(zhì)將混合物分離成不同組分的方法。這涉及到固定相（固體或附著在固體上的液體）和流動(dòng)相（液體或氣體）。流動(dòng)相流經(jīng)固定相，并攜帶混合物中的成分，與固定相相互作用較強(qiáng)的樣品成分通過色譜柱的速度比相互作用較弱的成分慢；這種速度上的差異會(huì)導(dǎo)致各種成分的分離。色譜法按流動(dòng)相和固定相的狀態(tài)分為氣相色譜、液相色譜、薄層色譜、凝膠色譜、超臨界流體色譜等。

液相色譜法的歷史可以追隨到20世紀(jì)初期。1906年俄羅斯的科學(xué)家茨維特（Tswett）為了分析從植物葉子中提取的色素，把溶解了植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入，沿管濾下，后用純石油醚淋洗。因?yàn)槭遣ＡЧ?，所以可以清楚地觀察管中的情況。隨著時(shí)間的推移，色素從碳酸鈣的縫隙中緩緩地往下流動(dòng)，最后分成了顏色不同的4層（如圖所示）。

經(jīng)過后來的研究，這4個(gè)層次中，青綠色的是葉綠素a，黃綠色的是葉綠素b，黃色的是黃嘌呤，橙色的是胡蘿卜素。這就是液相色譜的起源。但實(shí)際上，色素的四種成分從玻璃管中分離需要幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間，并不是非常實(shí)用的方法。液相色譜正式在各個(gè)領(lǐng)域運(yùn)用是從此后半個(gè)世紀(jì)后的1970年左右開始的。

高效液相色譜法（HPLC）基本上是柱式液相色譜法的一種高度改進(jìn)形式。溶劑不是在重力作用下滴過色譜柱，而是在高達(dá) 400 個(gè)大氣壓 (psi) 的高壓下強(qiáng)制流過，包括 HPLC 在內(nèi)的所有色譜分離都遵循相同的基本原理：由于不同分子對(duì)流動(dòng)相和分離所用固定相的相對(duì)親和力不同，因此可將樣品分離成不同的組分。

根據(jù)工藝中的相系統(tǒng)（固定），HPLC 有以下幾種類型：

正相 HPLC ：這種方法根據(jù)極性分離分析物。NP-HPLC 使用極性固定相和非極性流動(dòng)相。因此，固定相通常為硅膠。典型的流動(dòng)相有正己烷、二氯甲烷、氯仿、二乙醚和混合物。因此，極性樣品會(huì)被保留在色譜柱的極性表面上，比極性較弱的物質(zhì)保留時(shí)間更長。

反相 HPLC ：固定相為非極性（疏水性），流動(dòng)相為極性液體，如水和甲醇或乙腈的混合物。其工作原理是疏水相互作用，因此材料的非極性越強(qiáng)，保留時(shí)間就越長。

體積排阻 HPLC ：色譜柱中填充有精確控制孔徑的材料，顆粒根據(jù)其分子尺寸被分離。較大的分子會(huì)迅速通過色譜柱；較小的分子則會(huì)滲入填料顆粒的多孔內(nèi)部，隨后洗脫出來。

離子交換 HPLC：固定相表面帶有與樣品離子電荷相反的離子電荷。這種技術(shù)幾乎只用于離子或可離子化的樣品。樣品上的電荷越強(qiáng)，其被離子表面吸引的程度也就越強(qiáng)，因此洗脫時(shí)間也就越長。流動(dòng)相是一種水性緩沖液，pH 值和離子強(qiáng)度都用于控制洗脫時(shí)間。

HPLC 儀器包括輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)采集（處理）系統(tǒng)（如圖所示），其中系統(tǒng)的核心是進(jìn)行分離的色譜柱。

泵是HPLC系統(tǒng)中設(shè)置在最上方，把流動(dòng)相從溶液瓶中輸送到系統(tǒng)中的裝置。HPLC開發(fā)初期達(dá)到高壓力是泵的關(guān)鍵點(diǎn)，然而如今要保證高壓力顯然輕而易舉，所以對(duì)泵的要求變成了在任何條件下都能保持壓力和流動(dòng)相流速的穩(wěn)定。（流動(dòng)相流速的變化會(huì)對(duì)測(cè)定的結(jié)果造成不良影響）

大多數(shù)的泵，由于是利用類似于活塞運(yùn)動(dòng)那樣的往復(fù)運(yùn)動(dòng)，會(huì)對(duì)應(yīng)往復(fù)運(yùn)動(dòng)的周期而產(chǎn)生壓力變動(dòng)（這里稱為脈動(dòng)）。為了減少這種脈動(dòng)，花了很多功夫，如今的泵產(chǎn)生的脈動(dòng)已經(jīng)非常少了。然而，進(jìn)行從前無法想象的微量樣品高敏感度分析時(shí)，僅僅很小的流速變化都會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。所以，進(jìn)行高靈敏度分析時(shí)需要更高精度的泵。

進(jìn)樣器是設(shè)置在泵之后，把需要分析的樣品注入流動(dòng)相的裝置。最近，可以把多種樣品以一定時(shí)間間隔連續(xù)注入系統(tǒng)的自動(dòng)進(jìn)樣器也被廣泛的使用。

如今的色譜柱和茨維特實(shí)驗(yàn)使用的填滿碳酸鈣的玻璃管的原理一樣，但是柱子的材質(zhì)由玻璃管換成了不銹鋼管，中間的填料可以使用硅膠基質(zhì)填料和聚合物基質(zhì)填料。因?yàn)闃悠肥窃谏V柱中進(jìn)行分離，所以說色譜柱是整個(gè)HPLC系統(tǒng)中最重要的組成部分。

廣州研創(chuàng)的色譜柱產(chǎn)品圖

HPLC使用的流動(dòng)相，從酸性到堿性各種各樣的溶劑都有。由于不銹鋼對(duì)各種溶劑的耐受性都較好，所以HPLC用色譜柱大多使用不銹鋼材質(zhì)制成。然而，分析生化或者離子樣品時(shí)，樣品不能和金屬接觸，所以這種場(chǎng)合需要使用玻璃或者PEEK（聚醚醚酮樹脂）材質(zhì)的色譜柱。

樣品的分離在色譜柱中進(jìn)行，而分離后的結(jié)果需通過檢測(cè)器才能轉(zhuǎn)換成可以觀察的形式。不含有樣品的流動(dòng)相的組成是一定的，流動(dòng)相中包含了樣品其組成就會(huì)發(fā)生改變，檢測(cè)器可以將這種變化轉(zhuǎn)化為電子信號(hào)。檢測(cè)器根據(jù)不同的檢測(cè)方法分為很多種類，常用的檢測(cè)器有紫外吸收檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器和電化學(xué)檢測(cè)器。

即使使用檢測(cè)器把檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)化為了電子信號(hào)，也仍然不是能觀察的形態(tài)。為了使其可被分析觀察，以前是使用類似筆形記錄器的裝置，現(xiàn)在則使用基于電腦技術(shù)的數(shù)據(jù)處理器（也叫積分儀）。數(shù)據(jù)處理器從內(nèi)藏打印機(jī)的文字處理器這種簡易型式開始，已經(jīng)發(fā)展成顯示器、鍵盤、打印機(jī)各部分獨(dú)立的類似電腦的形式，種類繁多。而且，如今還有出售專門的電腦用HPLC分析軟件以及使用USB接口，即使是筆記本電腦也能簡單提取數(shù)據(jù)的系統(tǒng)。

以上介紹的部分，都是HPLC系統(tǒng)最基礎(chǔ)的部件。

高效液相色譜法（HPLC）已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用。此外，高效液相色譜法可獲得的信息包括化合物的分辨、鑒定和定量。它還有助于化學(xué)分離和純化。高效液相色譜的其他應(yīng)用包括：

制藥應(yīng)用：控制藥物穩(wěn)定性、藥物劑型的片劑溶出度研究、藥品質(zhì)量控制等。

環(huán)境應(yīng)用：檢測(cè)飲用水中的酚類化合物、污染物的生物監(jiān)測(cè)等。

法醫(yī)學(xué)應(yīng)用：生物樣本中的藥物定量、鑒定血液、尿液等中的類固醇、紡織品染料的法醫(yī)分析、測(cè)定血液、尿液等中的可卡因和其他濫用藥物等。

食品和香料：軟飲料和水的質(zhì)量測(cè)定、果汁中的糖分分析 蔬菜中多環(huán)化合物的分析、防腐劑分析等。

在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用：尿液分析、血液中的抗生素分析、肝臟疾病中膽紅素和膽綠素的分析、檢測(cè)腦細(xì)胞外液中的內(nèi)源性神經(jīng)肽等。