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如何輕松改善峰形與提升分離度？

欄目：行業(yè)資訊 發(fā)布時(shí)間：2024-07-15
在液相色譜分析中，改善峰形與提升分離度是確保分析結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的關(guān)鍵步驟。今天小研為大家整理了液相改善峰形與提升分離度相關(guān)的知識(shí)，僅供大家參考~

在液相色譜分析中，改善峰形與提升分離度是確保分析結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的關(guān)鍵步驟。今天小研為大家整理了液相改善峰形與提升分離度相關(guān)的知識(shí)，僅供大家參考~

01
選擇合適的流動(dòng)相


  1. 初始條件設(shè)定：
    • 對(duì)于常規(guī)色譜柱，一般先用90%的乙腈（或甲醇）/水（或緩沖溶液）進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以快速地得到初步的分離結(jié)果。
    • 而對(duì)于手性色譜柱，在正相模式下可以先用正己烷:異丙醇（或乙醇）=70:30比例進(jìn)行快速分離；在反相模式下可以用90%的乙腈（或甲醇）/水進(jìn)行試驗(yàn)，得到初步的出峰結(jié)果。
    • 根據(jù)出峰情況，逐步調(diào)整有機(jī)溶劑（乙腈或甲醇）的比例。每減少10%的有機(jī)溶劑量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。
  2. 流動(dòng)相性質(zhì)要求：
    • 低粘度：粘度應(yīng)低于2cp，高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，增加柱壓降，延長(zhǎng)分離時(shí)間。
    • 與檢測(cè)器兼容：例如，使用UV檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)無(wú)吸收或吸收很小。
    • 純度：流動(dòng)相中的雜質(zhì)可能在色譜柱上積累，影響色譜柱的壽命和分離效果，建議盡量使用色譜純的溶劑對(duì)樣品進(jìn)行分析。
    • 對(duì)樣品的溶解度適宜：如果溶解度不佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，影響分離效果和色譜柱性能。
    • 樣品易于回收：應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。
  3. 調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值：
    • 對(duì)于弱酸（4≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品，采用反相離子抑制技術(shù)，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值來抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，從而改善峰形。
    • 流動(dòng)相中加入適量的弱酸、弱堿或緩沖鹽溶液（如醋酸、三乙胺、磷酸鹽緩沖液等），以控制流動(dòng)相的pH值。

02
優(yōu)化色譜柱和操作條件


  1. 選擇合適的色譜柱：
    根據(jù)樣品的性質(zhì)和分離要求選擇合適的色譜柱類型如常規(guī)色譜（如C18、C8柱等）和手性色譜柱等，選對(duì)色譜柱往往可以實(shí)現(xiàn)事半功倍的效果。
  2. 調(diào)整合適的儀器操作條件：
    • 適當(dāng)?shù)牧魉倏梢蕴岣叻蛛x效率，但過高的流速可能導(dǎo)致峰形展寬和分離度下降。
    • 柱溫對(duì)分離效果也有影響，適當(dāng)提高柱溫可以加快溶質(zhì)在色譜柱中的傳質(zhì)速度，但也可能導(dǎo)致某些組分的熱降解，應(yīng)當(dāng)充分考慮樣品的穩(wěn)定性等因素。

03
流動(dòng)相脫氣與過濾

  1. 脫氣：
    • HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作、柱的分離效率以及檢測(cè)器的靈敏度和基線穩(wěn)定性。
    • 常用的脫氣方法有加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。超聲脫氣是一種較為簡(jiǎn)便有效的方法，但需注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸以防破裂。
  2. 過濾：
    • 所有溶劑使用前都必須經(jīng)過濾以除去雜質(zhì)微粒，即使是色譜純?cè)噭┮膊焕猓ǔ菢?biāo)簽上標(biāo)明“已濾過”）。
    • 分清有機(jī)相濾膜和水相濾膜的使用范圍，避免濾膜溶解導(dǎo)致溶劑污染。

04
注意事項(xiàng)

  • 在調(diào)整流動(dòng)相比例和pH值時(shí)，應(yīng)逐步進(jìn)行并注意觀察峰形和分離度的變化。
  • 定期清洗和更換色譜柱以保持其性能穩(wěn)定。
  • 確保實(shí)驗(yàn)室環(huán)境整潔、溫度濕度適宜以減少外部因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。
通過以上方法和策略的綜合運(yùn)用，可以顯著改善液相色譜分析中的峰形并提升分離度，從而獲得更加準(zhǔn)確和可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。