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手性色譜柱怎么用，七步搞懂！

欄目：行業(yè)資訊 發(fā)布時間：2024-07-18
手性色譜柱是液相色譜分析制備中經(jīng)典的耗材，如何正確使用手性色譜柱、延長手性色譜柱的使用壽命？拿到新的色譜柱我們應該干什么？還不知道的就跟小研一起來看看吧。
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01
色譜柱構(gòu)造

在使用手性色譜柱之前，讓我們先來了解一下手性色譜柱的基本結(jié)構(gòu)。色譜柱是由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。
（圖源于網(wǎng)絡，侵刪）


色譜柱柱管通常由不銹鋼、玻璃或聚合物材料制成，以確保足夠的機械強度和耐腐蝕性。


柱管的內(nèi)徑和長度根據(jù)應用需求有所不同，分析柱基本的內(nèi)徑范圍為2.1mm到4.6mm，長度從50mm到250mm不等，最常用的規(guī)格是4.6*250mm。

壓帽用于固定填料，防止填料在使用過程中泄漏。

篩板則用于支撐填料，確保流動相能均勻流過。

02
固定相

固定相又稱為色譜填料，是色譜柱的核心，是色譜分析的關鍵部分。在色譜分析中，流動相攜帶樣品通過色譜柱，樣品中的各組分在固定相與流動相之間發(fā)生分配、吸附、解吸等過程，從而實現(xiàn)組分的分離。分離后的組分隨流動相流出色譜柱，經(jīng)檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)后得到色譜圖。

手性固定相的類型有以下幾種：

  1. 多糖類：主要有纖維素型與直鏈淀粉型
    2. 纖維素由 β-D-葡萄糖單元通過 1,4-糖苷鍵連接而成的線狀聚合物。結(jié)構(gòu)高度有序、呈螺旋型空穴結(jié)構(gòu)的光學活性天然高分子。

    直鏈淀粉由 α-D-葡萄糖單元通過 1,4-糖苷鍵連接而成，存在一個左手四重螺旋結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)更為有序。直鏈淀粉的螺旋比纖維素要更大、更規(guī)律且更為剛性。

  2. 環(huán)糊精類
    3. 環(huán)糊精（Cyclodextrin，簡稱CD）是由直鏈淀粉經(jīng)酶發(fā)酵生成的一類寡糖化合物，常用的有α，β和γ-環(huán)糊精，分別包含6、7 和8個葡萄糖單元，其中β-環(huán)糊精應用范圍最廣。因為β-環(huán)糊精溶解度最好、剛性最強，疏水性空洞內(nèi)可嵌入各種對映體分子，形成包絡復合物，對手性分離有良好的選擇性，因此其衍生后特別適合芳香型化合物的手性分離。

  3. 蛋白質(zhì)類
    4. 如BSA牛血清蛋白，氨基酸殘基可提供手性位點，手性藥物對映異構(gòu)體與手性位點可以產(chǎn)生不同作用力，如氫鍵、疏水作用、靜電作用等，從而實現(xiàn)對映體拆分。
    BSA作為甲氨蝶呤的專用柱，已寫進中國藥典。

  4. 其他手性固定相
    如大環(huán)類（抗生素及冠醚）、配體交換型、分子印跡聚合物等……



03
流動相
流動相體系的選用是與固定相之間形成一個競爭機制，使得在流動相的洗脫下對映異構(gòu)體得到分離。

選定色譜柱后，可選用的溶劑種類就有了一個范圍，在色譜柱溶劑使用的范圍內(nèi)進行流動相體系的依次篩選。

首先使用常規(guī)流動相，如在正相體系下，優(yōu)先選擇正己烷、異丙醇、乙醇等的流動相，而反相體系下，優(yōu)先選擇乙腈、水、甲醇作為流動相。如拆不開再選用非常規(guī)的流動體系，如二氯甲烷、四氫呋喃、乙酸乙酯等。

但需要注意的是：涂覆型手性固定相禁用強溶劑作為流動相，如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯以及丙酮等，否則會使多糖衍生物溶解或溶脹，破壞固定相，只能用非極性烷烴和醇作為流動相。

此外，流動相體系還可以添加緩沖鹽，調(diào)節(jié)流動相的pH值和離子強度，從而影響手性化合物與手性固定相之間的相互作用，提高分離度和改善峰形。常用緩沖鹽主要有：磷酸鹽、銨鹽、硼酸鹽等。

04
新柱使用前的注意事項


1.新柱安裝：在使用新色譜柱之前，確保系統(tǒng)干凈，不含任何緩沖鹽和污染物 。

對于正相手性色譜柱，出廠保存條件為正己烷/異丙醇=90/10。使用時，請先用正己烷/異丙醇=90/10 沖洗色譜柱30 min，再更換為目標流動相穩(wěn)定系統(tǒng)至基線平穩(wěn)。


而反相手性色譜柱的色譜柱出廠保存條件為乙腈/水=90/10。使用時，請先用乙腈/水=90/10沖洗色譜柱30min，再更換為目標流動相穩(wěn)定系統(tǒng)至基線平穩(wěn)。


2.使用合適試劑：接入手性色譜柱前，須先用合適的溶劑沖洗流路（包括流通閥、定量環(huán)和自動進樣器）。

注意：部分溶劑（如丙酮、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氫呋喃等）強溶劑會破壞涂覆型手性固定相的結(jié)構(gòu)，因此不得使用它們作為流動相或溶劑溶解樣品。


3.逐步提高流速：當溶劑均勻的從柱出口端流出，停流速，將色譜柱出口端接到系統(tǒng)檢測器上，然后逐步提高流速至常規(guī)分析時所使用的流速。

05
色譜柱保養(yǎng)


1.定期測試：定期進行柱效測試，記錄理論塔板數(shù)、分離度與壓力，從而追蹤監(jiān)控色譜柱的性能變化。
2.保存條件：

正相手性色譜柱在使用含酸/堿添加劑的正相流動相后，需用正己烷/異丙醇=90/10沖洗色譜柱30min，然后用正己烷/異丙醇=90/10封存。

反相手性色譜柱在使用含酸/堿添加劑的反相流動相后，需用乙腈/水=90/10 沖洗色譜柱30min，然后用乙腈/水=90/10封存；使用含緩沖鹽流動相后，需要用不含緩沖鹽同比例流動相沖洗色譜柱30min，然后用乙腈/水=90/10封存。

3.避免極端條件：色譜柱應避免長時間處于極端pH或高溫條件下，這可能會導致色譜柱性能下降或老化 。

4.進樣前注意事項：


進樣前需過濾樣品溶液。


必須使用色譜級試劑配制流動相，使用前需經(jīng)0.45μm濾膜過濾和超聲脫氣處理。


反相流動相一般使用甲醇、乙腈、水，流動相允許的最高有機相比例為100%；最高的水相比例為60%。

06
pH適用范圍

以廣州研創(chuàng)手性色譜柱為例，pH適用范圍為2～8，手性固定相對手性化合物分離的選擇性主要依賴于立體選擇性相互作用，如氫鍵、π-π相互作用等，這些相互作用對pH值較為敏感，通常推薦在中性或接近中性的pH條件下使用，以避免對固定相的損傷或影響手性分離效果。



07
使用保護柱

保護柱對于確保手性色譜柱的長期穩(wěn)定運行和延長其使用壽命非常重要。保護柱能夠預先捕獲可能堵塞分析柱的顆粒物和其他雜質(zhì)，從而避免對分析柱造成損害。

此外，選擇保護柱時，應確保保護柱的填料與分析柱的填料一致，以保證選擇性的一致性。保護柱的規(guī)格，包括填料粒徑和內(nèi)徑，也應與分析柱相匹配。