色譜方法開發(fā)時,一般選擇常用的試劑、pH條件、緩沖鹽、以及常用色譜柱的組合作為起始條件,然后對流動相比例進行一系列調(diào)整,直至獲得比較滿意的峰形和分離效果,如何正確科學(xué)地選擇液相流動相呢?
液相流動相選擇原則 原則1:由強到弱 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進行試驗,這樣可以很快地得到分離結(jié)果,然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。 原則2:三倍規(guī)則 每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量,保留因子約增加3倍,此為三倍規(guī)則。這是一個聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過程中,注意觀察各個峰的分離情況。 當(dāng)分離達(dá)到一定程度,應(yīng)將有機溶劑10%的改變量調(diào)整為5%,并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率,直至各組分的分離情況不再改變。 小問題 RECRUIT 在配制流動相時我會遵循以上原則來加入一些添加劑來調(diào)節(jié)pH,常見的pH調(diào)節(jié)劑和緩沖鹽對到底有哪些呢? 他們能夠控制的pH范圍又是多少呢?調(diào)節(jié)劑又應(yīng)該從何說起? 常見的流動相 酸類 甲酸:通常使用的濃度在0.5%以下,能夠讓水的pH達(dá)到二點幾的級別。 乙酸:酸性比甲酸略弱,通常使用濃度不超過0.5%,能夠使水的pH到達(dá)到二點幾的級別。 三氟乙酸:比較強的酸,使用濃度通常不超過0.5%,能使水的pH達(dá)到2以下,具有很大的離子強度及一定的離子對作用,是分析蛋白/多肽時常用的添加劑。 磷酸:這是一種不揮發(fā)性的酸,離子強度也不錯,最重要的是,它在低波長紫外區(qū)無本底吸收。 缺陷 在于低波長下的紫外吸收,通常不建議在小于215nm波長的情況下使用,另外就是甲酸/乙酸具有比較大的揮發(fā)性,時間久了濃度會發(fā)生變化;而磷酸的缺點也不少比如不能兼容質(zhì)譜方法,對色譜柱壽命影響大等。除此之外,還有一些其他的酸,比如硫酸,鹽酸或者檸檬酸,但是都是非常罕見的使用了。 堿類 堿類添加劑常見的是氨水和三乙胺,兩者都能讓水的pH到達(dá)非常高的水平,高到能把硅膠顆粒溶解掉。 缺陷 氨水和三乙胺的pH非常高,使用時必須要謹(jǐn)慎,另外就是這兩種溶劑通常不太容易很干凈,尤其是三乙胺,即使是色譜純,放的久了也可能會由于變質(zhì)導(dǎo)致污染。 鹽類 甲酸鹽:通常在液相色譜中常用的甲酸鹽都是甲酸銨,而甲酸鹽與甲酸配合,可以得到甲酸-甲酸銨緩沖體系,大概緩沖能力在pH3~4.5的范圍之內(nèi),只要調(diào)節(jié)兩者濃度的比例即可。 乙酸鹽:常見為乙酸銨,在使用上,和甲酸鹽十分類似,離子強度也不高。與乙酸配合的乙酸-乙酸銨緩沖體系pH的控制能力在pH4~5.5左右。 磷酸鹽 :常用的是磷酸的鈉鹽和鉀鹽,二者對pH的控制能力十分接近,只是離子強度稍有差異,絕大多數(shù)情況下是可以互換使用的,磷酸由于是多元酸,能夠形成一氫鹽和二氫鹽,所以使用磷酸緩沖體系調(diào)節(jié)pH也是組合比較多,跨度比較大的,并且可以提供較高的離子強度。 磷酸-磷酸二氫鈉:pH1.2~3.1左右的范圍; 磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉:pH6.5~8左右的范圍。 缺陷 甲酸鹽:離子強度比較低,比較容易吸潮,稱量的時候比較困難,在流動相里還可能揮發(fā)。 磷酸鹽:流動相體系無法兼容質(zhì)譜,并且對色譜柱損傷較大。 最后,比起單純的酸堿,鹽類,特別是具有緩沖能力的鹽類可以很好的控制流動相的pH值,根據(jù)不同緩沖鹽中兩種鹽的配比,可以很容易的配置出一定pH的緩沖溶液。上述的緩沖對能調(diào)節(jié)的pH范圍指的都是在保持緩沖能力的范圍之內(nèi),如果僅僅是調(diào)節(jié)pH的話,范圍還可以再擴展一些。 此外,當(dāng)分析物含有可電離官能團時,(在不同pH條件下可處于不同程度的電離狀態(tài),如伯、仲、叔氨基、羧酸基),pH條件將強烈影響分析物的反相保留狀態(tài),也會造成最強烈的選擇性改變效果。 在選擇流動相時,應(yīng)避免在化合物分子的pKa值附近篩選pH條件,否則,pH值的微小變化都會導(dǎo)致保留和選擇性的劇烈變化。保留曲線的平臺區(qū)是分析方法耐用性較強的區(qū)域。流動相中有鹽時,應(yīng)確保鹽不會析出。 采用反相色譜法分離弱酸(3≤pKa≤7)或弱堿(7≤pKa≤8)樣品時,通過調(diào)節(jié)流動相的pH值,以抑制樣品組分的解離,增加組分在固定相上的保留,并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。
原則3:粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)
對于可電離的化合物,要獲得最強的反相保留,分析物應(yīng)盡可能的不帶電或電離,此時分析物極性相對較小,在反相色譜柱上的保留就更強,中性化合物無任何可電離基團,不受pH影響。
酸性和堿性化合物在其未電離狀態(tài)下時反向保留最大,中性化合物的保留不受pH影響。