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震驚！HPLC 色譜峰重疊難題竟被這樣破解

欄目：行業(yè)資訊 發(fā)布時(shí)間：2024-11-18
在HPLC（高效液相色譜）分析中，色譜峰重疊是一個(gè)常見(jiàn)的問(wèn)題，它可能由多種因素引起，并會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。今天小研來(lái)帶大家解決這個(gè)令人困擾的問(wèn)題，幫助大家的實(shí)驗(yàn)更加的順利的進(jìn)行。

在HPLC（高效液相色譜）分析中，色譜峰重疊是一個(gè)常見(jiàn)的問(wèn)題，它可能由多種因素引起，并會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。今天小研來(lái)帶大家解決這個(gè)令人困擾的問(wèn)題，幫助大家的實(shí)驗(yàn)更加的順利的進(jìn)行。


重疊峰的原因及解決辦法

重疊峰

首先我們來(lái)了解一下重疊峰，它是指在色譜分析中，兩個(gè)或多個(gè)組分的色譜峰相互重疊的現(xiàn)象。這通常發(fā)生在復(fù)雜的樣品分析中，其中不同組分在色譜柱上的分離度不夠好。重疊峰可能導(dǎo)致難以準(zhǔn)確解析色譜峰，從而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。


重疊峰



原因分析


  1. 化合物性質(zhì)相似：

    2. 不同化合物出峰時(shí)間相近：當(dāng)樣品中存在多種性質(zhì)相似的化合物時(shí)，它們可能在色譜柱上的保留時(shí)間相近，從而導(dǎo)致色譜峰重疊。

    同一化合物的異構(gòu)體或構(gòu)型：某些化合物存在異構(gòu)體或不同構(gòu)型，例如手性化合物存在R構(gòu)型和S構(gòu)型手性異構(gòu)體，這些異構(gòu)體或構(gòu)型在色譜柱上的保留時(shí)間也可能相近，從而引起峰重疊。


  2. 樣品雜質(zhì)干擾：

    3. 如果樣品中存在雜質(zhì)，這些雜質(zhì)可能會(huì)與目標(biāo)化合物在色譜柱上發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附，導(dǎo)致目標(biāo)化合物的色譜峰變形或重疊。


  3. 色譜柱性能問(wèn)題：

    4. 色譜柱長(zhǎng)時(shí)間使用后，柱頭可能受損或固定相污染，導(dǎo)致峰形變寬或出現(xiàn)多個(gè)峰，從而引起色譜峰重疊。

    色譜柱的老化、污染或損壞都可能導(dǎo)致色譜峰形異常。需要定期更換或清洗色譜柱，以保持其性能。

    色譜柱的選擇不合適，如填料類(lèi)型、柱長(zhǎng)、內(nèi)徑等不匹配，也可能導(dǎo)致峰重疊。


  4. 實(shí)驗(yàn)條件不匹配：

    5. 流動(dòng)相的組成、pH值、流速等參數(shù)與樣品不匹配時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致峰形變形或出現(xiàn)多個(gè)峰，從而引起色譜峰重疊。此外，樣品要現(xiàn)配現(xiàn)用，避免樣品溶解液的有機(jī)相比例、pH值發(fā)生變化而導(dǎo)致的溶劑效應(yīng)。



解決方法

  1. 優(yōu)化色譜條件：


    2. 選擇合適的色譜柱：根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇合適的色譜柱，如極性、非極性、離子交換、手性等類(lèi)型的色譜柱。

    調(diào)整流動(dòng)相：流動(dòng)相的組成對(duì)色譜峰形有重要影響?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)整流動(dòng)相的組成，如改變有機(jī)溶劑的比例、添加緩沖劑等，來(lái)改善色譜峰形。

    如下圖案例中，使用廣州研創(chuàng)EnantioPak?Y1手性色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行拆分過(guò)程中，通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相有效解決了峰重疊的問(wèn)題，使每個(gè)峰都能達(dá)到良好的分離。

    色 譜 柱：EnantioPak?Y1（250*4.6mm，5μm）

    柱溫：25℃

    進(jìn) 樣 量：10μL

    流速：1.0mL/min

    檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm


    流動(dòng)相：正己烷（0.1%TFA）：乙醇=80:20 

                       優(yōu)化前的圖譜                   

    調(diào)整流動(dòng)相比例：正己烷（0.1%TFA）：乙醇=88:12 

           優(yōu)化后的圖譜：   

    通過(guò)調(diào)整增大流動(dòng)相正己烷和減小乙醇的比例峰型得到了有效改善。


    調(diào)整流速：流速過(guò)快或過(guò)慢都可能影響色譜峰形，例如手性色譜柱的典型流速在1.0 mL/min。通過(guò)調(diào)整流速，可以嘗試降低流速增加樣品在色譜柱中的停留時(shí)間，從而提高分離度，找到最佳的分離條件，避免峰重疊。

    調(diào)整柱溫和進(jìn)樣量：適當(dāng)提高柱溫或降低進(jìn)樣量，有助于改善分離效果。


  2. 進(jìn)行樣品前處理：

    3. 純化樣品：通過(guò)適當(dāng)?shù)募兓椒ㄈコ龢悠分械碾s質(zhì)，如常見(jiàn)的萃取法、洗滌法、固相萃取法、離子交換法、膜過(guò)濾法等，以減少峰重疊的可能性。

    選擇合適的溶劑：用與流動(dòng)相相溶的溶劑溶解樣品，如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會(huì)使柱子惡化，常見(jiàn)溶劑互溶表見(jiàn)下圖。



  3. 注意操作細(xì)節(jié)：

    4. 在進(jìn)行HPLC分析時(shí)，注意操作細(xì)節(jié)，如進(jìn)樣方式：手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)速度必須快，一般應(yīng)在1s之內(nèi)。進(jìn)樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)造成峰展寬、前伸或拖尾變形。進(jìn)樣量一般液體0.1-5μL，進(jìn)樣太多，會(huì)使色譜峰展寬，造成前伸、拖尾或重疊而分離不好。

    如果是使用自動(dòng)進(jìn)樣器，需檢查進(jìn)樣系統(tǒng)是否存在氣泡、樣品瓶是否裝得過(guò)滿(mǎn)、是否存在進(jìn)樣針座堵塞或漏液等。

    還需注意色譜柱的安裝和連接、如安裝前檢查好色譜柱的流向、流動(dòng)相的配制和更換等，以確保分析的準(zhǔn)確性和可靠性。


  4. 更換色譜柱：

    5. 如果色譜柱性能下降嚴(yán)重，無(wú)法通過(guò)以上方法改善分離效果，可以考慮更換新的色譜柱。選擇性能更好、更適合樣品性質(zhì)的色譜柱，有助于改善分離效果。


總之，多個(gè)峰重疊是液相色譜檢測(cè)中經(jīng)常遇到的問(wèn)題，但只要找到問(wèn)題的原因并針對(duì)性地解決，就能有效地處理。