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破解HPLC色譜峰面積重現(xiàn)性差難題

欄目：行業(yè)資訊 發(fā)布時(shí)間：2025-01-02
在使用高效液相（HPLC)色譜系統(tǒng)進(jìn)行日常分析檢測(cè)的過(guò)程中，有時(shí)會(huì)遇到色譜峰峰面積重現(xiàn)性差的問(wèn)題，導(dǎo)致無(wú)法對(duì)組分進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

在使用高效液相（HPLC)色譜系統(tǒng)進(jìn)行日常分析檢測(cè)的過(guò)程中，有時(shí)會(huì)遇到色譜峰峰面積重現(xiàn)性差的問(wèn)題，導(dǎo)致無(wú)法對(duì)組分進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

重現(xiàn)性是指不同分析人員或不同實(shí)驗(yàn)室在各自的條件下所得分析結(jié)果的精密度，即使是給到了相同的開(kāi)發(fā)方法也會(huì)有方法不重現(xiàn)的時(shí)候，這是什么原因呢？可以從色譜柱、儀器系統(tǒng)、方法本身的穩(wěn)定性這三方面去排查。

01
色譜柱問(wèn)題的排查

首先檢查色譜柱的性能是否完好，觀察色譜峰形和柱效變化情況，確認(rèn)色譜柱是否被污染。如果色譜柱被污染，可以使用更強(qiáng)的洗脫溶劑沖洗色譜柱。


如果是由于更換色譜柱導(dǎo)致方法不能重現(xiàn)，那么就是色譜柱間的差異問(wèn)題，同一種鍵合相，不同廠家的會(huì)不一樣，同一廠家的也有很多款，即使同一款色譜柱，還有批次差異問(wèn)題。但一般情況下，同一款色譜柱，批次差異都是比較小的。

02
儀器系統(tǒng)的排查

儀器系統(tǒng)的排查可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行排查：

1）進(jìn)樣量
確認(rèn)樣品是否過(guò)載，進(jìn)樣量不符合要求或者進(jìn)樣時(shí)操作失誤，都可能導(dǎo)致色譜峰面積重現(xiàn)性差。如果是使用手動(dòng)進(jìn)樣器且方法要求進(jìn)樣量小于定量環(huán)體積，必須使用合格的小體積進(jìn)樣針完成進(jìn)樣，且盡可能控制每次進(jìn)樣體積一樣。如果是使用自動(dòng)進(jìn)樣器，需檢查進(jìn)樣系統(tǒng)是否存在氣泡、樣品瓶是否裝得過(guò)滿、是否存在進(jìn)樣針座堵塞或漏液等。

2 ）流動(dòng)相

確認(rèn)流動(dòng)相是否新鮮配制的，比例有無(wú)錯(cuò)誤。檢查溶劑瓶里的溶劑過(guò)濾器是否長(zhǎng)菌，有沒(méi)有被堵塞。樣品與流動(dòng)相起始比例不兼容，有的樣品組分在梯度起始流動(dòng)相里可能析出，需要調(diào)整合適的流動(dòng)相。

3 ）注射器

檢查注射器內(nèi)是否有氣泡，如果有氣泡，可以把注射器填充滿去除氣泡，或者使用脫氣溶劑。

4 ）核查檢測(cè)器參數(shù)
應(yīng)核查檢測(cè)器的各項(xiàng)參數(shù)：比如UV檢測(cè)器的溫度（若設(shè)置溫度）是否穩(wěn)定，CAD檢測(cè)器的載氣流速、氣體壓力是否正常等。

03
方法的穩(wěn)定性問(wèn)題
1）分析可離子化的化合物時(shí)，未在流動(dòng)相中使用緩沖鹽，或鹽濃度不足。

2）流動(dòng)相的pH與待分析物的pKa接近。

3）對(duì)流動(dòng)相比例敏感，盡量使用同一臺(tái)儀器，或者流動(dòng)相預(yù)混并記錄好具體混合方法，包括試劑的添加順序，甚至記錄量取時(shí)的試劑溫度。

4）緩沖溶液的pH須在加入有機(jī)相前進(jìn)行調(diào)節(jié)。

04
結(jié)語(yǔ)

高效液相色譜方法重現(xiàn)性好是確保分析結(jié)果可靠性的關(guān)鍵因素。可以通過(guò)色譜柱、儀器系統(tǒng)、方法本身的穩(wěn)定性這三方面去排查和優(yōu)化，有效提升HPLC色譜峰面積的重現(xiàn)性，為科研和生產(chǎn)提供更加準(zhǔn)確、可靠的分析數(shù)據(jù)支持。