手性分析方法開發(fā)過程中，根據化合物的結構特點或者是進行初步的開發(fā)嘗試，確定了影響分離有效性的關鍵因素如色譜柱的類型以及流動相的種類以及操作模式之后，就需要對是否需要使用添加劑以及哪一種添加劑做出選擇，一些其他的操作條件諸如流速，色譜柱柱溫等進行優(yōu)化，以此獲得良好的分離效果。

　　1、色譜柱溫度的影響

　　如我們所知，溫度在HPLC方法開發(fā)中占據舉足輕重的地位，在范式方程中表達為傳質阻力項，溫度越高，對于流動相而言其粘度越小(如下表乙醇的粘度隨溫度的變化)，而儀器背壓也就越低。更重要的是，升高溫度減小了傳質阻力，溶質在兩相之間的分配速率亦會隨之增加，色譜柱的理論塔板高度降低，色譜柱的柱效亦會增加。

　　因此增加色譜柱的溫度，可以提高色譜柱的柱效，體現在色譜峰上，峰形更加尖銳，峰寬降低，并一般多伴隨色譜峰的容量因子減??；降低色譜柱的溫度，則色譜峰峰形變鈍，峰寬增加，并一般多伴隨容量因子增加。

　　而對于選擇性因子以及拖尾因子而言，需要具體情況具體分析，分別對待。此外，不同的手性液相色譜柱所允許的操作溫度范圍不同，在方法開發(fā)的時候，注意不要超過色譜柱所耐受的溫度范圍，以免損傷色譜柱，導致使用壽命減短。

　　2、有機溶劑中痕量水的影響

　　在正相HPLC操作模式中，我們常使用正己烷、正庚烷作為非極性洗脫劑，乙醇、異丙醇等醇類作為極性洗脫劑，而有機醇類流動相在開瓶之后，會吸收空氣中的水分，使得有機溶劑中混入一些痕量的水，而這些痕量的水，有時候會對手性分析方法的開發(fā)帶來干擾(有時負面影響，有時正面影響)，甚至影響分析方法開發(fā)的進程以及分析方法的轉移，特別是對于涂覆型的多糖衍生物的手性色譜柱。

　　選擇了合適的色譜柱，流動相的組成以及操作模式只是手性分析方法開發(fā)成功的必要條件，還需要對色譜儀器的操作條件進行優(yōu)化，如流動相中的添加劑的種類以及添加量，流動相的流速的大小，溶解樣品所用的溶劑等，均對分析方法主要關注點如分離度，拖尾因子，保留時間產生很大的影響。